NC：国内唯一企业！华大联合全球11家实验室，共建DIA蛋白定量标准

继2017年参与发表Nature Communications 后，华大作为国内唯一企业，再次与全球9个国家、11家实验室合作，共同建立了一套大队列DIA蛋白定量标准流程，可确保多中心、多实验室间产出稳定、灵敏、可重复的数据，助力精准医学研究。相关文章“Standardization and Harmonization of Distributed Multi-National Proteotype Analysis supporting Precision Medicine Studies”于2020年10月16日发表在Nature Communications上，且入选其生物质谱专题Nature Communications Biological Mass Spectrometry。

为何要建立大队列DIA蛋白定量标准？

基因组（Genome）研究无疑是当前发展精准医学的主要驱动力，然而仅凭患者的基因型又往往不足以支持临床决策，临床表型和基因型之间存在着gap，亟需其他各种类型的数据来填补。

而蛋白质基因组学（Proteogenomics）作为精准医学数据完善的重要一环，旨在研究蛋白质型与基因型的关系，已经成为推进基础、转化和临床研究的一门朝阳学科。一些国际性的计划包括APOLLO（Applied Proteogenomics Organizational Learning and Outcomes network）和ICPC（the International Cancer Proteogenome Consortium）也已经证实了蛋白质基因组学在精准医学以及患者护理中的重要地位。这些计划均依赖多中心的协作以及数据共享，才能够代表全球患者的多样性。然而当前面临的严峻问题是，多中心数据生成在基因组学领域已经实现，在蛋白质基因组学领域还尚未实现。

因此，迫切需要建立以质谱为平台的大队列样品蛋白分析策略，提供可靠和可重复的定量数据，并在多中心、多实验室之间实现协同研究。

与传统DDA（Data Dependent Acquisition）蛋白定量技术相比，DIA（Data Independent Acquisition）蛋白定量具备鉴定数高、重复性好、定量准确性高、周期短、费用低等优势。DIA能够扫描区间内所有的肽段母离子，通过二级离子信号的峰面积进行定量，真正做到全景式、高通量、高精度。因此，DIA非常适合大规模临床样品的蛋白质组研究，能够高效地支持精准医学应用的高通量临床蛋白组分析。

为了获得可重复和更稳定的定量数据集、促进多中心的协同工作，DIA方法的标准化有必要且亟待解决。

建立了什么样的DIA标准化流程？

本研究建立了一套以QC为基准的HRMS1-DIA（High-resolution MS1-based quantitative data-independent acquisition）流程。在9个国家、11家实验室，对QC样品和模拟的2例生物学样品进行7天不间断的Q Exactive HF检测，使纵向模式和/或不同实验室获取的数据可以在数据库分析过程中进行比较和规范化。

对获得的数据首先基于QC样品进行质控，质控指标包括色谱峰宽中值、MS1和MS2采样速率、母离子和蛋白质鉴定数、母离子信号CV中值。这些指标提供了可靠的输出数据和平台状态的实时监测，包括色谱和质谱的属性，同时也能被用于诊断仪器可能存在的问题，以便在研究中对大量样本保持高通量的检测。

图1 HRMS1-DIA流程

这套标准化流程性能如何？

筛选满足QC验收标准的10家实验室，对其样品A和B数据进行性能分析。

1. 蛋白鉴定和定量情况

FDR为1%时共鉴定蛋白7600+（图2a）；定量到的总蛋白和各物种蛋白分布如图2b，其中人类蛋白~4000、酵母蛋白2000、大肠杆菌蛋白400。

图2 样品A和B蛋白鉴定数

2. 日间重复性和室间重复性评估

每个实验室平均定量蛋白6500+（RSD < 4%），在1、3、5、7四个数据采集天中，每个实验室每天定量到的蛋白数目，均超过该实验室整体定量蛋白的80%，表明每个实验室的日间重现性极佳（图3a）。

另外，所有实验室都定量到的蛋白为5784个，占每个实验室定量蛋白的80%，其中4565个蛋白在每个实验室、每个采集天都能被定量到，表明实验室间重复性也同样优秀。

图3 定量蛋白质组覆盖的重复性分布

3. 定量准确性评估

一般而言，人和酵母样品的定量错误率中位数理论上低于10%，大肠杆菌的低于20%。从图4可以看出，10家实验室实际检测结果的错误率低于理论值。另外，人和酵母蛋白的CV中位数通常低于5%，大肠杆菌蛋白的低于10%，表明所有实验室的分析定量精确度都非常高。

图4 蛋白质定量分析的精密度和准确性分布

这套标准化流程的临床应用情况如何？

三家实验室采用建立好的标准化HRMS1-DIA，对4例卵巢癌FFPE组织分选获得的上皮性肿瘤细胞进行了检测，以评估所建立流程的可行性和实际运行情况。整体检测流程如图5a。

共定量5712个蛋白，筛选显著差异表达蛋白394个（图5b），其中18个蛋白与已有成熟检测方法所得结果进行了相关性分析，相关性系数R为0.802（图5d）。3家实验室均定量到的18个蛋白，其定量平均相对标准偏差为15.45，标准误差为1.43（图5e）。

图5 采用标准化HRMS1-DIA对卵巢癌样品进行检测

该研究表明使用这种标准化策略从临床标本中获取蛋白型数据是切实可行的，为跨多家实验室/研究机构的大规模临床样本的分布式多组学数字化研究铺平了道路，是将分子精准医学变为现实的先决条件。

该研究也再次展示了华大DIA蛋白定量的超硬实力，作为国内DIA的商用首推者，华大一直在进步，时刻保持该技术的全球领先地位！

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原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-020-18904-9

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